一般組織検査用及び
           免疫組織検査用包埋樹脂システム 


◆低温重合樹脂テクノビット7100/8100  

組織学的検査において信頼性を得る基本的条件は、薄切切片の優れた表現性および高分解能です。 このことから今日、組織標本に対する樹脂による包埋がますます重要になっております。 確実にかつ正確な検査を行うなめの主たる条件は、出きる限り処理温度を低くすることです。 さらに樹脂を用いることにより包埋および薄切が容易に行うことが出来、また低コストで信頼性の高い結果が得られることです。

ヘレウス・クルツァー社が著名な科学者及び研究所と共同で開発したヒストテックシステムは医学、獣医学、植物学において、素晴らしく良好な結果が得られております。 本システムは包埋の際に発生する重合温度の低温処理、0.5ミクロンの薄切切片の作成、良好な伸展及び染色反応など、すべての必要条件を満たしております。 新しく開発された、低温重合樹脂、テクノビット8100は、ヒドロキシメタックリレート(HEMA)を主成分としており、免疫組織学的検査を行うことが出来ます。 このように、ヒストテックシステムにより、組織切片検査における科学的及び経済的諸条件はかなり向上しました。


テクノビット樹脂に関しての参考資料

長年電子顕微鏡・光学顕微鏡樹脂に精通されて、多大な研究実績を残されてきた日本女子大学 理学部・物質生物科学科 黒岩晴子先生からテクノビット7100・8100に関しての先生ご自身の実際の取り扱い方法をご教授いただきましたので、下記に紹介いたします。

1.従来、パラフィン切片で抗体反応をされてきた方に、利点と言えばテクノビット樹脂は脱樹脂の必要がない事、600nm〜800nmの厚さで切れるため、固定が良ければ組織レベルから細胞レベルでの情報が得られること、また透過光用の色素だけでなく蛍光組織でも良く染色されるため、免疫蛍光抗体反応も可能です。

2.テクノビットの種類について、抗体反応用として8100が販売されていますが、当初7100・8100両方を試してみたところ、7100で十分抗体反応が良く検出されるので、取り扱いが面倒な8100ではなく、7100で研究しています。 これまで7100包埋切片で、通常の染色、蛍光染色、抗体反応、autoradiography, in situ hybridization, BrdU抗体反応等、やって上手くいきました。 

3.例えば細胞内の情報を得たいという事で、切片は700nm前後の厚さで切っております。 その為ミクロトームはウルトラミクロトームを使っており、サンプルが小さいようであれば、Lieca ultracut UCT ウルトラミクロトームを使われるのも良いと思います。

4.電子顕微鏡でも光学顕微鏡でも同じですが、良い像を得るには固定と包埋が一番大事だと思います。 こちらは実験材料として植物組織を使っていますが、厚いcell wallや復層した組織がある為、なかなか液が浸透しません。 そこで実際に行っている方法は:

固定:固定液;4%パラフォルムアルデヒド(用事調整) 又は1〜2%グルタルアルデヒド(アンプル入りの電子顕微鏡用の物) Buffer::10mMカコジル酸またはリン酸Buffer。 固定液にサンプルと固定液を入れて、サンプルが沈むまで脱気します。 沈んだら新しい固定液に替えて0℃で4h〜Over night固定します。(この時沈まないものは固定されていませんので、使えません。) 脱水:アルコールシリーズで100%迄もっていきます。

置換:テクノビット7100!100ml):硬化剤T(1g)の割合でよく混ぜ合わせ予備浸漬液をつくります。(私はファルコンに入れて充分振って混ぜます。 サンプル+100%アルコールを入れた固定瓶をダックローターの上に乗せ、ゆっくり回転させながら置換を行います。 固定瓶の中に少しづつテクノビット予備浸漬液を垂らします。 (2〜3滴ずつ垂らして振り混ぜます。 これを5分おきぐらいに繰り返し、2時間かけて繰り返します。 次に液を全部100%予備浸漬液に取り替えて、over night で回転させます。 翌日また100%予備浸漬液に取り替えて2〜3時間回転させます。

包埋:包埋用のプラスチックケース等を用意いたします。(私は昔のフィルムケースを使っていますが、蓋つきのビームカプセルも良いと思います。 テクノビット溶液:テクノビット予備浸漬液100ml:硬化剤U 15mlの割合でよく混ぜ合わせます。 直ぐに硬化し始めますので、手早く、しっかり混ぜ合わせて使用します。 サンプルを容器に並べ、テクノビット溶液を注ぎます。 サンプルが頭を出さないように、十分に入れます。 蓋をして冷蔵庫で一晩おきます。 (急ぐときは40〜50℃の恒温器中で蓋を取って3時間incubateして取り出します。 翌日蓋を取り、室温で1〜2時間おきます。 テクノビット3040を用意します。 容器に粉末1:溶液2ぐらいの割合(ドロドロの状態)で入れ、。楊枝などでかき混ぜ、すぐにサンプルの表面に流し込みます。(空気を遮断するためサンプルがスッカリ隠れるように)。 3040を流し込むと、5〜10分で硬化します。硬化したら容器から取り出して出来上がりです。 テクノビットは吸湿性なので、出来上がったサンプルのプレートは恒温器中または乾燥剤と一緒に保存します。

薄切:サンプルを糸鋸で切り出して、土台にアロンアルファで貼り付けて上部をトリミングし、ミクロトームに取り付けて切り出します。 切片はカバーグラスの上に拾います。 カバーグラスに水滴を何滴か用意します。(切片よりやや大きめに)。 切片を切り出し、それをピンセットで拾います。 拾った切片をカバーグラスの上の水滴に拾います。 (切片の端をピンセットでつかみ、水滴に触れると同時にピンセットを開く。) その際切片が丸まらないように、水がピンセットにつかないように気を付けて、切片が水の上にうまく広がるように注意します。 ホットプレートを40〜50℃に温めて、ろ紙を乗せ、その上にカバーグラスを置いて乾かします。


テクノビット7100およびテクノビット8100による標本の包埋

両樹脂とも医学、生物学分野における軟組織および硬組織の包埋、薄切切片を容易にする為に開発されました。 更に、テクノビット8100においては免疫組織学的検査を行う事が可能です。 包埋時の重合温度をできるだけ低く維持するため、底面が放熱性の良い精錬鋼からなる特殊テフロン製包埋モールド(ヒストフォーム)を同時に開発しました。 このヒストフォームを正しく使用することにより、確実な低温重合を行う事が可能です。

ミクロトームの特性に応じて、ディスポーザブルミクロトームナイフを用いることにより、0.5ミクロン厚さの切片を作成することが出来ます。 

テクノビット7100およびテクノビット8100は、いずれもグリコールメタクリレートを主成分としております。 他の包埋樹脂と比較した場合、テクノビットの方が明らかに毒性が低いので、特に研究室での使用に適しております。 安価で経済的かつ効果的に使用するために、システムの内容を更に解り易く、シンプルにしました。 カバーフォイル: テクノビット8100は、酸素に非常に敏感ですので、重合が始まる前に充填モールドに気泡が生じないようにするとともに、大気中の酸素と接触しない様にしなければなりません。

「主な特長」


#03-1001 包埋樹脂テクノビット7100セット \37,000.-

    包埋樹脂テクノビット7100の構成

主剤: 500ml

硬化剤(1): 1gx5袋

硬化剤(2): 40ml

Technovit7100は、医学・生物学分野における軟組織試料の包埋、及び薄切切片作成を容易にするために開発された新しい樹脂です。 包埋の際、組織試料に与える熱影響を軽減するため、放熱性の良い特殊包埋型も同時に開発され、組み合わせ使用により最高の包埋結果が得られます。

(テクノビット7100の取り扱い方法)

組織を2−ヒドロキシエチルメタクリレート(GMA)で包埋するための新しい重合システムについてーバルビツール酸誘導体塩化物イオンおよび過酸化ベンゾイルとの組み合わせによりGMAの重合が始まります。 この触媒システムには芳香族アミンが含まれておらず、この事は化酸化物/アミンに基づいた既存の触媒系と比較して、かなり特長があると言えます。 本システムにより、1〜2ミクロンの切片の作成を容易にする透明な樹脂ブロックが得られます。

固定: カーノブスキー(1965)の方法に従ってパラホルムアルデヒドから調製した4%中和ホルムアルデヒドに浸漬または灌流により組織切片を固定します。

脱水: 70%エタノール、室温で2時間 − 96%エタノール、室温で2時間 − 100%エタノール、室温で1時間。

予備浸漬: 100%エタノール/テクノビット7100等量、室温で2時間。

浸漬液: テクノビット7100、組織の大きさ及び構造に応じて、24時間以内。

包埋処理液の成分: A.浸漬液 ○テクノビット7100(補触媒XCLを含有するHEMA)100g○硬化剤T(過酸化ベンゾイル、水分含有率20%)1g B.包埋液 ○浸漬液A 15ml○硬化剤U(硬化促進剤として、バルビツール誘導体を含有) 1ml これらの溶液は1分間充分に攪拌する事。 浸漬後、包埋モールド(ヒストフォーム)に1個当たり約1mlの包埋液Bを入れ、この中に標本組織を置く。

重合: 室温(23℃)で1時間、その後さらに37℃で1時間。

ヒストブロックの固定: 包埋液が重合硬化したらヒストブロックをヒストフォームの上にセットします。 次に固定樹脂テクノビット3040を2:1ないしは3:1の割合(体積比)で、粉末と液体を混合してヒストブロック内に流し込みます。 室温(23℃)で5〜10分で硬化し包埋標本はヒストブロックに硬く接着固定されますので、容易に標本を1〜2ミクロンの厚さに薄切することができます。

切片の作成: 室温にてカッティングした切片を蒸留水中で伸展させ、解剖針またはブラシにより切片をスライドガラスにのせます。 伸展した切片は、染色する前に60℃で約15分間乾燥させてください。 脱樹脂せずとも組織化学染色および組織学的染色がおこなえます。

以上の説明方法に従ってテクノビット7100を使用すれば、GMA-ベンゾイルペルオキシド/芳香族アミンシステムと比較して、次のような利点があります。

Kidney (Mouse)
Silver impregnation acc. to Movat
Human retina
Methylene blue-fuchsine
Embryo (Mouse) day 15
Mallory acc. to Richardson
Striated muscle
Silver impregnation acc. to Movat
Lung
MZ
Skin (finger tip)
HE
Intestine
PAS/Fast Green
Kidney
Alkaline phosphatase(evideence a. Burstone)

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#03-1002 包埋樹脂テクノビット8100セット \48,000.-

    包埋樹脂テクノビット8100の構成

主剤: 500ml

硬化剤(1): 5x0.6g

硬化剤(2): 30ml

カバーフォイル: 500枚

テクノビット8100は低毒性で、ほとんど無臭の可塑剤と水溶性樹脂との組み合わせからなる新しい樹脂です。 本樹脂は、診断病理学の領域において、2年間、試験を行いました。 あらゆる種類の医学用組織、植物組織の包埋はもとより、特にリンパ組織(リンパ節、胸腺、脾臓、扁桃)肝および腎の生検材料、ならびに非脱灰生検材料免疫組織化学的検査に適しております。

(テクノビット8100の取り扱い方法)

序説: 固定、脱水および浸漬中は、組織を連続的に振動させる必要があります。

固定: 固定時間は短い方が望ましい。 最高1mmまでの厚さの非脱灰骨髄生検材料の組織切片はPH7.4のリン酸緩衝液に溶解した2%パラホルムアルデヒド中で4℃にて3〜4時間浸漬して固定します。 その後、6.8%スクロースを含有するPH7.4のリン酸緩衝食塩液中で4℃にて一晩組織を洗浄します。

脱水: 100%アセトン中で4℃にて組織の脱水を1時間行います。 最初の5分間は溶液が透明に保たれるまでアセトンを新しく交換します。

浸漬: テクノビット8100を用いて4℃で6〜10時間浸漬させます。 A.浸漬液 テクノビット8100主液 100ml(HEMAジヒドロキシエチルメタクリレート及び可塑剤としてのヒドロキシエーテル)硬化剤T 0.6g ペルオキシドルシドールCH-50を混和して4℃にて冷却します。 B.包埋液 浸漬液A 30ml 硬化剤 U 1ml を4℃で混和します。 浸漬後、包埋液B中に組織を浸漬した後、4℃で5分間攪拌します。 充分に混和した包埋液Bを包埋フォーム(ヒストフォームS)に流し込み、標本をその中に入れます。 そして、その上にカバーフォイルを、各々の桝目の中の標本の上に載せて密封します。

重合: 重合中(少なくとも3時間)は、包埋フォームを4℃の冷蔵庫の中で砕いた氷の上に置いておきます。

ヒストブロックの固定: PEフォイルがはがす事が出来ますので、急速に硬化する固定樹脂テクノビット3040(粉末2〜3:液1)を、ヒストブロック内に流し込みヒストブロックを固定します。 重合時間は約10分。 尚、標本ブロックは、プラスチック容器にて−20℃で保存する事が出来ます。

切片の作成: ロータリー式ミクロトームの使用をお勧めします。 1〜2ミクロンの切片を蒸留水の中で伸展させ、スライドガラスの上に載せて、37℃で約2時間乾燥させます。 すぐに使用しない切片は室温で乾燥させた後、4℃で保存することが出来ます。 スライドガラスをアルシアンブルーまたはポリリジンでコーティングすることも可能です。

0.1%ポリリジン溶液(シグマ)

Kidney/glomerulus, 2 micron
Alkaline phosphatase
Human tonsil
Immunoperoxidase staining using a mono-
clonal directed against the CD3 complex
Human tonsil
immunoperoxidase staining using L26 mono-
clonal antibody
Muscle, 2 micron
Methylene blue/acid fuchsin
Oral epithelium (stratum comium)
Anti keratin
Human tonsil
Large magnification of a section stained for
CD30 positive cells
Human tonsil
Immunoperoxidase staining using MB1 mono-
clonal antibody
Human tonsil
immunofluorescence staining using an a
Lambda monoclonal antibody
Prolifaration centre of the developing fair
Anti BrdUrD
Human tonsil
immunoperoxidase staining using a lgD
monoclonal antibody
Human tonsil
immunoperoxidase staining using S100
monoclonal antibody
Liver, 2 micron
a-naphtylacetat esterase

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(GMAで包埋した組織の免疫反応のための染色手順)

  1. 37℃で2時間乾燥させます。

  2. 酵素的前処理:0.1%塩化カルシウムとともに0.01%トリプシンPH7.8中で5〜10分間培養させます。 (37℃)

  3. 液を数回交換しながら、リン酸緩衝液(PBS)中で5分間洗浄します。

  4. 一次抗体を37℃で2時間培養します。

  5. 液を数回交換しながら、PBS中で5分間洗浄します。

  6. 0.06%過酸化水素リン酸緩衝液(PBS)溶液で室温にて30分間内因性ペルオキシダーゼを遮断します。

  7. 液を数回交換しながらPBS中で5分間洗浄します。

  8. 二次抗体を室温で30分間培養します。

  9. 液を数回交換しながら、PBS中で5分間洗浄します。

  10. クリオスタット切片については、ジアミノペンジン(DAB)を用います。

  11. 水中で3分間青色染色します。

  12. グリセリンゼラチンおよびカバーグラスをカバーします。

AP法、PAAP法、APAAP法、ABC法、アピジンービオチン法および蛍光抗体法に従って免疫組織化学的検査を行う事が出来ます。 洗浄緩衝液中に結合剤を使用しないのが望ましい。 緩衝液にはベルオキシダーゼを溶解して下さい。

1988年より取り組んできた本システムには、次のような特長があります。

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●#03-1003 ヒストフォーム Sタイプ 砲弾型(10×16×6.5mmブロックサイズ)

重合硬化時の標本組織に対する熱影響を軽減し、又包埋および切削を容易にする標本ブロックが得られます。 ヒストフォームSは、特殊な形状を呈しており、新しいタイプの包埋モールドです。

特長

重合温度を測定した結果、この容積においてテフロンと精錬鋼からなるヒストフォームの使用により、重合温度がかなり低下することが確認されました。

●#03-1004 ヒストフォーム Qタイプ 角型(20×16×10mmブロックサイズ) 

ヒストフォームQは、ヒストフォームSと同様の特長を持ちますが、比較的大きな標本を包埋するために開発されました。 包埋樹脂の品質が一定であり、包埋モールドも特殊なテフロン製のため重合温度は再現性があります。

重合時の最高温度に対する環境温度との相関関係

ヒストフォームS

包埋樹脂 室温 +20℃ 冷蔵庫 +4℃ 冷蔵庫内の氷上
テクノビット8100 30:1 69 21 12
テクノビット8100 35:1 67 19 11
テクノビット8100 40:1 65 - -
テクノビット7100 32 16 10

ヒストフォームQ

包埋樹脂 室温 +20℃ 冷蔵庫 +4℃ 冷蔵庫内の氷上
テクノビット8100 30:1 - 69 48
テクノビット8100 35:1 - 52 42
テクノビット8100 40:1 - 50 41
テクノビット7100 37 23 18

● 包埋標本固定台ヒストブロック 

良好な切片を得るため、重合硬化したテクノビット7100には弾力性を持たせてあります。 その為、切片作成の際は、固定台にしっかりと固定してミクロトームに装着する必要があります。 Kulzer社は使いやすく、経済的なディスポーザブルタイプの固定台ヒストブロックを開発しました。

特長

● 固定樹脂テクノビット3040(黄色)

テクノビット3040は、メチルメタクリレートを主成分とする急速硬化樹脂で、包埋樹脂テクノビット7100とヒストブロックを確実にシッカリと固定します。 テクノビット3040は、粉末と液体で構成され、簡単に混合できます。 混合比、粉末2〜3:液1のとき最高の固定、接着性能を発揮し5〜10分で固定できます。

@ #03-1006 固定樹脂テクノビット3040 100g粉末+80ml液(コンビネーション) 1セット \14,000.-

A #03-1007 固定樹脂テクノビット3040セット( 1,000g粉末+500cc液) 1セット\45,000.-

■ ヒストブロックの使用方法

1。ヒストブロックをセットする 2。テクノビット3040を注ぐ 3.ブロックごと試料を取り出す

● ミクロトーム用ヒストナイフHおよびナイフホルダー

クルツァー社が開発したヒストナイフHは、テクノビット7100/8100のような包埋樹脂を薄切するためのディスポーザブルナイフです。 刃の角度は約45度、新金属により作られておりますので、軟らかな包埋樹脂や組織は勿論のこと、比較的硬い組織およびMMAのような硬い包埋樹脂も切削できます。

#03-1008 ヒストナイフ Hタイプ 30枚入(中止品)  #03-1009 ヒストナイフ Hタイプ 100枚入(中止品) 

#03-1010 ヒストナイフホルダー 17cm \180,000.-

#03-1011ヒストブレード 50枚 \35,000.-

   
高価なガラスナイフや研磨が面倒なスチールナイフにかわる画期的な新しいタイプのナイフです。 刃の寿命が長く、標本を低コストで効率的に処理できます。 特にテクノビット7100/8100の切削にはより良好な結果が得られます。 両側に締め穴がついているので受傷などの損傷を伴うことなくナイフをホルダーから外す事が出来、また容易におこなえます。 ヒストナイフは、保存中の錆びを防ぐため、オイルコーティングされております。

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